Una introducción a los métodos de ensayo para el ADN residual de células huésped en productos biológicos

Las células huésped son la piedra angular de los productos biológicos, y las líneas celulares de mamíferos se han convertido ahora en los huéspedes más utilizados para la expresión y preparación de productos biológicos. Las células huésped comunes incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), células Vero de riñones de mono verde africano y células de riñón embrionario humano (HEK 293).

Riesgo de ADN residual de células huésped

Carcinogenicidad

El mecanismo carcinogénico primario deADN residual de la célula huéspedEs La introducción de oncogenes dominantes, como MYC y RAS. Estos oncogenes dominantes pueden transformar directamente las células normales, lo que hace que algunas células normales se diferencien en células tumorales. Las mutaciones de inserción del ADN de la célula huésped residual también son factores cancerígenos potenciales.

Infectividad

El ADN residual de la célula huésped puede contener genomas virales infecciosos, que pueden producir partículas virales infecciosas a través de la replicación y la amplificación de la transcripción. Por lo tanto, el riesgo de infectividad del ADN de la célula huésped residual podría ser mayor que su riesgo cancerígeno.

Inmunogenicidad

Debido a que el ADN genómico de fuentes microbianas es rico en CpG y secuencias no metiladas, aumenta el riesgo de inmunogenicidad de los fármacos proteicos recombinantes in vivo. Por ejemplo, las secuencias ricas en CpG de las bacterias pueden desencadenar respuestas inmunitarias mediadas por TLR (receptores similares a Toll).

Métodos de detección del ADN residual de la célula huésped

Hibridación de la sonda de ADN

En este método, el ADN exógeno en la muestra de ensayo se desnaturaliza a hebras individuales y se adsorbe en una membrana de fase sólida. Bajo ciertas condiciones, puede volver a hibridar con sondas de ADN monocatenario complementarias marcadas con marcadores para formar ADN bicatenario. Sin embargo, los resultados de detección del método de hibridación tienen discrepancias significativas con el contenido real de ADN de la célula huésped residual, y el método es inestable con tiempos de detección relativamente largos.

Tinción fluorescente

Este método utiliza tintes fluorescentes de ADN bicatenario que se unen específicamente al ADN bicatenario para formar complejos, produciendo una fuerte señal fluorescente cuando se excita a una longitud de onda de 480 nm. La señal fluorescente a 520 nm se detecta usando un fluorómetro. La Intensidad de fluorescencia es proporcional a la concentración de ADN. Sin embargo, la señal fluorescente de este método se interfiere fácilmente y tiene poca especificidad, lo que requiere evitar la contaminación del ADN ambiental, y todos los Materiales y reactivos utilizados deben estar libres de ADN.

PCR cuantitativa

Actualmente, el método más convencional para detectar el ADN de la célula huésped (HCD), esta técnica implica la monitorización en tiempo real del proceso de PCR a través de señales fluorescentes para analizar cuantitativamente la plantilla. Basado en principios químicos, se puede dividir en dos tipos: el método de sonda TaqMan y el método de tinte SYBR.

El Método de sonda TaqMan utiliza sondas oligonucleotídicas específicas de genes marcadas con colorantes fluorescentes durante la reacción de PCR para detectar el producto, mientras que el método de tinte SYBR agrega un exceso de colorante fluorescente al sistema de reacción de PCR. El tinte se incorpora específicamente a la doble hebra de ADN y emite una señal fluorescente. El Método de sonda TaqMan aumenta la especificidad a través del paso de reconocimiento de la sonda, mientras que el método de tinte SYBR es más simple y sencillo.